Kontrast Hoffmana

Kontrast Hoffmana jest jedną z technik mikroskopowania dzięki której możemy obserwować półprzezroczyste obiekty w preparatach biologicznych z wysokim kontrastem i wrażeniem ich trójwymiarowości. Dzięki mniejszej ilości zastosowanych komponentów jest to tańsze rozwiązanie niż kontrast DIC, jednocześnie charakteryzując brakiem efektu halo występującym w kontraście fazowym.

Technika modulacji kontrastu wg Hoffmana została wynaleziona przez dr. Roberta Hoffmana w 1975 r. Dzięki zastosowaniu kilku dodatkowych elementów – mianowicie wsuwek ze szczelinami, polaryzatora i filtrów polaryzacyjnych – stało się możliwe uwypuklenie przezroczystych obiektów fazowych lub słabo kontrastowych obiektów biologicznych.

Obserwowany obiekt, który w jasnym polu byłby niewidoczny, staje się z jednej strony jaśniejszy a z drugiej strony ciemniejszy, natomiast środek i tło pozostają w tym samym kolorze. Taki płaski obraz preparatu wydaje się trójwymiarowy. Należy pamiętać, ze uzyskany obraz nie stanowi realnego odtworzenia trójwymiarowego obiektu.

Technika ta przekształca różnice w natężeniu światła powstałe po przejściu przez szczeliny w kondensorze i płytki modulujące w obiektywie w różnice w natężeniu światła w obrazie, co przekłada się na znacznie wyższy kontrast i daje tzw. efekt cienia. Technikę kontrastu Hoffmana możemy stosować z dowolnymi preparatami zarówno barwionymi jak i niebarwionymi, szczególnie z obiektami fazowymi.

Może być zastosowana zarówno w świetle przechodzącym jak i odbitym, także świetle spolaryzowanym i fluorescencyjnym.

Głównie technika ta znalazła zastosowanie do obserwacji hodowli komórkowych jak i obserwacji zapłodnienia pozaustrojowego, gdzie przezroczyste komórki są praktycznie nie widoczne w technice jasnego pola.

Opis metody

Zestaw do kontrastu Hoffmana składa się z trzech podstawowych elementów:

1) Wsuwki ze szczelinami, w których jedna ze szczelin pokryta jest filtrem polaryzującym:

We wsuwkach znajdują się płytki ze szczelinami. Każdy z obiektywów ma swoją, przypisaną płytkę oznaczoną powiększeniem obiektywu.

2) Kondensora z gniazdem na wsuwkę oraz obrotowym polaryzatorem:

3) Specjalnych obiektywów z obrotową płytką będącą modulatorem:

Dodatkowo do ustawienia układu korzysta się z teleskopu centrującego:

Po wsunięciu wsuwki, szczeliny znajdują się w płaszczyźnie ogniskowej kondensora.

 

Jedna z dwu szczelin w płytkach znajdujących się w kondensorze jest pokryta filtrem polaryzacyjnym. Gdy kierunek polaryzacji polaryzatora jest równoległy do polaryzacji szczelinowej, efekt trójwymiarowy jest najbardziej widoczny; natomiast gdy kierunek polaryzacji polaryzatora jest prostopadły do polaryzacji szczelinowej, rozdzielczość szczegółów jest wyższa.

Podobna płytka, zwana modulatorem, znajduje się w obiektywie. W płytce znajdującej się w obiektywie nie znajdują się pojedyncze szczeliny, lecz trzy strefy – jedna przepuszczająca całkowicie światło, druga częściowo przepuszczająca światło (pokryta filtrem polaryzacyjnym) a trzecia niemal całkowicie nieprzepuszczająca światła.

Obraz szczeliny z kondensora jest tworzony w tylnej płaszczyźnie ogniskowej obiektywu, gdzie znajduje się modulator, dzięki czemu możliwe jest poprawne ustawienie układu za pomocą specjalnego teleskopu centrującego. Przygotowanie układu kontrastu Hoffmana do obserwacji polega na równoległym ustawieniu szczelin kondensora ze strefami w obiektywie tak aby strefy z filtrem polaryzacyjnym obiektywu pokrywały się z szczelinami kondensora bez filtru polaryzacyjnego

Po ustawieniu układu można rozpocząć obserwację. Światło wpadając do kondensora, wpada do pozaosiowej szczeliny oraz przechodzi przez polaryzator, następnie pada na próbkę i wchodzi do obiektywu. Umieszczenie szczelin poza osią optyczną, dają oświetlenie skośne, które Zwiększa rozdzielczość układu optycznego.

Kontrast Hoffmana a inne techniki mikroskopowania
– Kontrast Hoffmana pozostawia obraz w tych samych barwach, ponieważ wpływa jedynie na regulację kontrastu (natężenia) światła, a nie na jego fazę.

– Kontrast Hoffmana ma przewagę nad kontrastem fazowym, ponieważ ze względu na ukośne oświetlenie próbki obraz sprawia wrażenie trójwymiarowego, rzucającego cienie; nie powstają świetlne obwódki (tzw. halo) powstałe w obserwacji w kontraście fazowym.

– W porównaniu z obserwacją DIC: koszt akcesoriów jest mniejszy, a dwa akcesoria polaryzacyjne niezbędne do DIC nie są wymagane; nie wykorzystuje się właściwości dwójłomności kryształu, więc próbkę można umieścić w plastikowym lub szklanym pojemniku, a pogorszenie się efektu polaryzacji nie spowoduje pogorszenia obrazu.

Mała głębia ostrości jako narzędzie do obserwacji warstw komórek

Układ optyczny do obserwacji próbek w kontraście Hoffmana charakteryzuje się niedużą głębią ostrości nawet przy małych powiększeniach. Paradoksalnie jest to atut wykorzystywany w badaniu próbek warstwowych, na przykład w obserwacji kolejnych warstw komórek w hodowlach komórkowych. Dzięki małej głębi ostrości możemy obserwować ostry obraz kolejnych warstw preparatu bez widocznych fragmentów sąsiadujących warstw, jak widać na rysunku poniżej:

Możemy zatem porównać mikroskop do skalpela, za pomocą którego „odcinamy” kolejne warstwy preparatu, umożliwiając obserwację interesującego nas obszaru.

Kontrast Hoffmana jako zaawansowana technika mikroskopowania.

Kontrast fazowy jest techniką stosowaną w laboratoriach do obserwacji półprzezroczystych, słabo widocznych struktur biologicznych, jak również do obserwacji drobnych obiektów wymagających wysokiej rozdzielczości. Dzięki temu znakomicie sprawdzi się na przykład w obserwacjach hodowli komórkowych, niewybarwionych tkanek czy preparatów nieutrwalonych, na przykład mikroorganizmów w kropli wody.

Dodatkowym atutem tej techniki jest duża odległość robocza kondensora (względem np. techniki kontrastu DIC), dzięki czemu, jak wspomniano wcześniej, jest często stosowana w procedurach in vitro, które wymagają zastosowania naczyń laboratoryjnych ( szalek, butelek, płytek wielodołkowych).

 

Dodaj komentarz

Twój adres e-mail nie zostanie opublikowany. Wymagane pola są oznaczone *